ELISA là một kỹ thuật được sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học, ứng dụng rộng rãi trong các ngành y học, thực phẩm, nông nghiệp,… Trong y học, kỹ thuật ELISA được ứng dụng trong các xét nghiệm HIV, các bệnh viêm gan siêu vi hay các bệnh lý nhiễm ký sinh trùng,…

1. Nguyên lý kỹ thuật ELISA

ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent assay) là một phương pháp sinh hoá sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự hiện diện của một kháng thể hoặc kháng nguyên trong một mẫu.

Hình 1: Nguyên lý ELISA

Nguyên lý của kỹ thuật ELISA là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể và được thực hiện bằng những bước cơ bản sau: Kháng nguyên – antigen (KN) hoặc Kháng thể – antibody (KT) đã biết được gắn trên một giá thể rắn, sau đó cho mẫu có chứa kháng thể – antibody (KT) hoặc kháng nguyên (KN) cần tìm vào giếng. Bổ sung thêm kháng thể có gắn với ezyme. Bước cuối cùng thêm cơ chất (substance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu màu có thể xác định được bằng máy đo huỳnh quang.

2. Các phương pháp ELISA

ELISA trực tiếp (direct ELISA): Phương pháp này thường sử dụng trong ELISA định tính, ít dùng trong định lượng. Phương pháp này có ưu điểm là chỉ cần một lần ủ do đó tiết kiệm thời gian và tối thiểu được việc kiểm soát các điều kiện trong quá trình thực hiện (thay đổi nhiệt độ và buffer cho mỗi lần ủ, tính thời gian…). Tuy nhiên, nhược điểm của nó là nhuộm màu nền (background staining) cao do sự liên kết không đặc hiệu của kháng thể với bề mặt rắn và các protein cố định trên bề mặt rắn. Việc đánh dấu từng loại kháng thể sử dụng cho mỗi kháng nguyên cũng khá tốn kém, nhất là khi phải chẩn đoán một số lượng lớn các loại kháng nguyên khác nhau.

ELISA gián tiếp (indirect ELISA): Ưu điểm của phương pháp này là độ nhạy cao chỉ cần tạo một loại kháng kháng thể mang enzyme để nhận biết cho nhiều kháng nguyên khác nhau. Tuy nhiên nhược điểm của nó là tăng số bước thực hiện do đó làm tăng việc kiểm soát các điều kiện, quá trình thực hiện xét nghiệm và kéo dài thời gian chẩn đoán.

ELISA sandwich: Phương pháp này có khá nhiều ưu điểm vượt trội, thứ nhất là độ nhạy cao giảm được nhuộm màu nền và các phản ứng không đặc hiệu do đã loại bỏ được hầu hết các thành phần tạp, phản ứng được thực hiện dễ dàng hơn.

Hình 2: Các phương pháp kỹ thuật ELISA

ELISA cạnh tranh (competitive ELISA): ELISA cạnh tranh là phương pháp ELISA rất hiệu quả cho định lượng các yếu tố hiện diện trong mẫu với lượng nhỏ. ELISA cạnh tranh sử dụng một lượng kháng nguyên cùng loại với kháng nguyên mà ta muốn định lượng trong mẫu (kháng nguyên cạnh tranh) cho phản ứng miễn dịch với cùng một loại kháng thể đặc hiệu cố định trên mặt rắn, sau đó đo lượng kháng nguyên cạnh tranh này thông qua hoạt tính enzyme được liên kết với nó. Kháng nguyên cạnh tranh càng hiện diện nhiều cho biết loại kháng nguyên đó trong mẫu càng ít và ngược lại.

3. Những điều cần lưu ý khi thực hiện kỹ thuật ELISA

Do kỹ thuật ELISA là kỹ thuật miễn dịch bán tự động nên kết quả xét nghiệm sẽ bị ảnh hưởng nhiều bởi các yếu tố như: con người, dụng cụ thao tác, hóa chất, thiết bị phân tích. Để quản lý chất lượng tốt các kỹ thuật xét nghiệm ELISA yêu cầu phải thực hiện đúng theo quy trình của mỗi loại xét nghiệm.

3.1. Dụng cụ và hóa chất

– Ống nghiệm.

– Giá đựng ống nghiệm.

– Micropipette có các thể tích khác nhau từ 1^l đến 1000^l.

– Đầu type nhựa gắn vào Micropipette.

– Giấy thấm.

– Máy rửa giếng ELISA.

– Máy đọc ELISA.

– Bộ hóa chất gồm có:

+ Các thanh nhựa đã gắn kháng nguyên/kháng thể + Dung dịch rửa.

+ Calibration + Chứng âm + Chứng dương.

+ Cộng hợp.

 + Cơ chất.

+ Dung dịch pha loãng huyết thanh.

+ Chất ngưng phản ứng.

3.2. Mẫu bệnh phẩm

+ Sử dụng mẫu máu tĩnh mạch được cho vào vào ống nghiệm sạch không chứa chất chống đông hoặc có chứa chất chống đông (Heparin/EDTA) tùy theo yêu cầu từng loại xét nghiệm.

+ Mỗi mẫu máu sẽ được để vào các ống nghiệm riêng biệt có dán mã Barcode và tên tuổi đầy đủ, có nắp vặn kín.

+ Các mẫu máu được cho vào hộp kín vận chuyển về phòng xét nghiệm trong thời gian sớm nhất.

+ Thông thường các mẫu máu để làm các xét nghiệm ELISA sẽ ổn định trong 12h ở nhiệt độ phòng từ 20 – 25 ºC, nhiệt độ 2 – 8 ºC ổn định trong 24 – 48h.

+ Tại phòng xét nghiệm các mẫu máu sẽ được phân phối về khu vực thực hiện từng xét nghiệm riêng và mã hóa số mẫu theo từng dịch vụ xét nghiệm để hạn chế việc lây nhiễm chéo hoặc nhầm lẫn mẫu bệnh phẩm.

3.3. Quản lý chất lượng

Kỹ thuật ELISA là kỹ thuật miễn dịch bán tự động cho nên việc quản lý chất lượng trong quá trình làm xét nghiệm đóng một vai trò vô cùng quan trọng. Cần thiết phải đưa ra những quy trình kiểm soát chất lượng chặt chẽ tại mỗi bước thực hiện:

+ Trước xét nghiệm: Mẫu bệnh phẩm phải đạt yêu cầu không được vỡ hồng cầu, không nhiễm khuẩn, nồng độ mỡ máu cao cũng ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.

+ Trong xét nghiệm: Thực hiện Calibration và Control trong mỗi lần thực hiện mẫu theo đúng yêu cầu của từng bộ kít xét nghiệm.

+ Sau xét nghiệm: Kết quả mẫu bệnh nhân chỉ được chấp nhận khi đường Calibration và Control trong cùng một lần thực hiện đạt kết quả tốt. Kết quả sau khi thực hiện phân tích xong nên sử dụng các phần mềm ghi nhận kết quả trực tiếp, tránh ghi bằng tay gây sai số kết quả do nhầm lẫn khi vào sổ.

3.4. Quy trình kỹ thuật

Thực hiện theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Quy trình gồm các bước chính sau đây:

• Bước 1: Cho mẫu bệnh nhân, chứng âm, chứng dương vào giếng nhựa đã gắn sẵn kháng nguyên/kháng thể. Ủ ở nhiệt độ phòng hoặc 37 ºC, thời gian ủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
• Bước 2: Rửa các giếng bằng dung dịch đệm PBS – Tween 20, thấm giấy cho ráo nước.
• Bước 3: Cho cộng hợp vào mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng hoặc 37 ºC, thời gian ủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
• Bước 4: Rửa các giếng bằng dung dịch đệm PBS – Tween 20, thấm giấy cho ráo nước.
• Bước 5: Cho cơ chất vào mỗi giếng, chờ cho màu xuất hiện (15 – 30 phút).
• Bước 6: Cho dung dịch ngưng phản ứng.
• Bước 7: Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA tự động

Hình 3: Phản ứng ELISA sandwich

Tóm lại trong mỗi bước của quy trình kỹ thuật ELISA đều có khả năng ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm nếu như người kỹ thuật viên thực hiện không làm đúng theo quy trình đã xây dựng. Các yếu tố nguy cơ hay gặp có thể dẫn đến sai số kết quả là:

+ Hóa chất không để ổn định ở nhiệt độ phòng trước khi làm xét nghiệm.

+ Hút sai thể tích mẫu pha loãng, sai thể tích thuốc thử.

+ Thời gian ủ và nhiệt độ không đúng: gây âm tính hoặc dương tính giả.

+ Rửa không sạch: nên sử dụng máy rửa tự động để đảm bảo đủ thể tích nước rửa và số lần rửa, không thấm khô khay mẫu sau khi rửa xong.

+ Không đọc kết quả ngay sau khi dừng phản ứng.

3.5. Biện luận kết quả

– Ngưỡng dương tính có thể khác nhau đối với từng loại xét nghiệm. Biện luận kết quả dựa trên ngưỡng dương tính do nhà sản xuất đưa ra.

– Các kỹ thuật miễn dịch phát hiện kháng thể cho kết quả gián tiếp, không có giá trị tuyệt đối.

– Kết quả âm tính cũng không loại trừ hoàn toàn không nhiễm bệnh, có thể do mới bị nhiễm, hoặc bị nhiễm quá lâu, hoặc lượng kháng nguyên/kháng thể quá ít để có thể phát hiện được bằng phương pháp ELISA. Trong trường hợp nghi ngờ mắc bệnh trên lâm sàng nên làm lại xét nghiệm sau 1-2 tuần. Xét nghiệm vài lần để theo dõi biến động của kháng thể/ kháng nguyên có giá trị hơn là xét nghiệm một lần. Nếu cần, phải kiểm tra lại bằng các kỹ thuật khác.

– Kết quả dương tính cũng không khẳng định hoàn toàn vì có thể dương tính giả do phản ứng chéo giữa các loại ký sinh trùng hoặc căn nguyên gây bệnh.

Vì vậy, các phản ứng miễn dịch tìm kháng nguyên/kháng thể không thể thay thế hoàn toàn xét nghiệm trực tiếp trong chẩn đoán nguyên nhân bệnh. Kết quả xét nghiệm, dù âm hay dương, cũng cần được xem xét một cách cẩn thận, kết hợp với các yếu tố dịch tễ hoặc những xét nghiệm bổ sung khác (sinh học phân tử, nuôi cấy tế bào…) và những hỗ trợ phi lâm sàng khác (XQ, siêu âm…).